Американские учёные сделали ещё один шаг к разгадке механизма процесса создания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Соединяя эмбриональные стволовые клетки мыши с человеческими фибробластами для создания гетерокарионов – клеток, содержащих два или более ядер и имеющих различные генотипы, – Хелен Блау (Helen Blau) с коллегами из Стэнфордского университета разработали новый способ изучения процесса клеточного перепрограммирования. Исследователи полагают, что подавление фибробластов ростовыми факторами стволовых клеток приводит к более эффективному и ускоренному перепрограммированию человеческих ядер в гетерокарионах. Так, в экспериментах Блау уже на второй день после слияния у 70% клеток наблюдалась экспрессия маркеров плюрипотентности – огромный скачок по сравнению с менее чем 0,1% в случае индуцирования плюрипотентности с помощью всех разработанных до настоящего времени методик.
Используя новый метод, исследователи изучили роль деметилирования ДНК, одного из важнейших этапов процесса перепрограммирования фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. В результате было установлено, что в перепрограммированных гетерокарионах деметилирование происходит на промоторах хорошо известных генов плюрипотентности OCT4 и NANOG, а также соотносится с увеличением экспрессии обоих генов. Кроме того, учёные наблюдали деметилирование в отсутствие клеточных делений и репликации ДНК, что, вопреки распространённым представлениям, позволяет сделать предположение об активном характере этого процесса в ходе перепрограммирования.
Чтобы понять механизм деметилирования, учёные направили свои усилия на фермент под названием «индуцируемая активацией цитидиндезаминаза» (activation-induced cytidine deaminase AID), обнаруженный ранее в половых клетках и, предположительно, выполняющий определённую функцию в общем деметилировании в эмбрионах рыбки данио. За сутки до эксперимента учёные блокировали AID в стволовых клетках мышей и человеческих фибробластах. В полученных в результате гетерокарионах экспрессия обоих генов – OCT4 и NANOG – была значительно слабее, как и деметилирование. Сверхэкспрессия AID в этих клетках полностью исключила деметилирование и экспрессию NANOG и частично OCT4. Таким образом, деметилирование двух ключевых генов плюрипотентности составляет важный этап клеточного репрограммирования, решающая роль в котором принадлежит ферменту AID.
Не останавливаясь на достигнутом, исследователи продолжили эксперименты и подтвердили непосредственное участие AID в процессе деметилирования. Реакция деметилирования ДНК играет важную роль в развитии млекопитающих, отмечено её значение в развитии онкологических заболеваний и процессе старения, однако ключевые факторы этого процесса до сих пор известны не были. Доктор Блау не спешит безоговорочно приписывать деметилирование ферменту AID и считает, что он действует не один. По её словам, точный механизм деметилирования всё ещё представляется довольно расплывчатым. Авторы исследования полагают, что AID каким-то образом инициирует процесс восстановления ДНК, заменяющий метилированные основания на неметилированные, однако его детали ещё предстоит проработать.
В планах учёных – установить, действует ли AID аналогично и в других методах индуцирования плюрипотентности, а также могут ли добавки AID повысить эффективность этих методов.
Авторы также надеются, что гетерокарионный метод позволит им окончательно раскрыть механизм клеточного перепрограммирования, первый шаг к которому они уже сделали, выделив ключевой фактор процесса деметилирования ДНК.